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一、文章來源

文章下載鏈接://www.wfsmjl.com.cn/uploads/tmp/genedenovo-resume-1413439133.1232745.pdf

荔枝退化葉的轉錄組組裝及活性氧脅迫導致的差異表達基因的找尋。周碧燕,華南農業大學。

二、背景

為了找到應對措施,了解荔枝花蕾發育背后的遺傳學信息非常重要。
用Illumina RNA-seq構建了一個荔枝早期葉的參考轉錄組,為了弄清活性氧誘導的與葉衰老、脫落相關基因網絡,用數字基因表達譜分析活性氧處理的早期葉轉錄組動態分析圖譜。

背景:荔枝書屬熱帶、亞熱帶廣泛種植的常綠木本樹。在全球變暖、氣候變化時導致的開花缺陷對于荔枝生產是主要挑戰。以前的研究已經表明,高溫條件可促進花蕾中早期葉的生長并且抑制荔枝開花,而甲基紫精二氯化物(MV)誘導的活性氧可以促進早期葉的衰老、脫落。為了解活性氧在荔枝開花過程中的分子功能,對荔枝進行了轉錄組測序并從頭進行組裝。

三、結果:
組裝得到 82036 unigenes,58%(47596)在Nr數據庫中能找到高度相關的注釋。
5223 unigenes 被發現在活性氧處理組與非處理組的早期葉中差異表達,并且與植物激素信號組分(如脫落酸和乙烯)相關的編碼基因顯著富集。

四、材料與方法

1. 材料與處理

生長于華南農業大學實驗果園,13年樹齡的荔枝經濟種植品種。將新長出的約6cm長的樹枝切下并立即放入水中。兩小時后,將樹枝用40μM的MV溶液處理。所有樹枝放入20 ℃、160μmol/m2s1光量子通量密度的培養室中。

如圖1A中第3和第4處的早期葉MV處理0小時,5小時,10小時后,進行取樣,在液氮中冷凍并儲存在-80℃用于RNA測序和定量qRT-PCR。
 

前期研究發現,早期葉衰老脫落的前期特征是出現向下生長的葉子。為證實MV的處理效果,將樹枝用MV處理后,測量了3與4處的近端角α和遠端角β。處理后近側角α(如圖1A)沒有顯著變化,而遠端角β在處理后顯著增大(表1)。這說明活性氧處理后能顯示出早期葉衰老和脫落(圖1B,C,D)的早期征兆。

2. 測序、De novo組裝與注釋

2.1 轉錄組組裝結果

6-10個樹枝混合葉作為一個樣本,在0h、5h、10h每個樣本兩個重復。

為了得到荔枝早期葉的參考轉錄組,將6個測序的樣本數據組裝到一起

2.2 轉錄組注釋結果

A:4個常用的蛋白數據庫的注釋結果
B:Nr數據庫的注釋情況
C:被注釋到的unigenes物種情況

28,556 unigenes 大部分在4個物種中找到注釋, 包括
Glycine max(大豆), Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula(苜蓿) 和Populus trichocarpa(毛果楊)

Unigenes的GO注釋

23,278 unigenes 能夠被GO數據庫分成3類

Unigenes的KEGG注釋


荔枝早期葉的13728個unigenes能夠比對到KEGG的274條代謝通路中

6個DGE文庫中reads覆蓋度統計

不同的Reads覆蓋種類的分布在6個文庫中有相似的形式

重復實驗可靠性驗證
顯示其方法上有很好的重復性

3. 基因的差異表達注釋

以0h作為對照組,5h、10h作為處理組。
差異表達基因篩選條件: unigenes 符合 FDR ≤ 0.001 且 log2 Ratio ≥ 1
5223個unigenes被選出,認為有差異表達,并用來進行后續分析。

3.1 差異表達基因的GO分析

為查看5223個DEGs的表達趨勢, 0h到10h的活性氧處理表達量數據歸一化為0, log2 (υ5h/υ0h), log2 (υ10h/υ0h). 用STEM 軟件將所有 DEGs 趨勢分為8類。

顯著DEGs(A-D) 的GO 分類

3.2 差異表達基因的KEGG富集分析

 28.6% (1,494/5,223) 的DEGs 能夠被注釋.
DEGs注釋到的最有代表性的前10個KEGG代謝途徑于表4中列出

植物激素信號轉導
(ko04075),
淀粉和糖代謝(ko00500),
細胞周期(ko04110),
嘧啶代謝
(ko00240),
嘌呤代謝(ko00230),
植物病原相互作用(ko04626) 和
內質網途徑的蛋白加工(ko04141).

3.3 與活性氧反應信號轉導通路相關差異表達基因分析

3.4 KEGG中與植物激素信號傳導通路相關的差異表達基因的表達量熱圖繪制

基因表達量數據被歸一化為Z值

4. qRT-PCR驗證差異表達基因

確認的轉錄組分析結果的準確性和再現性, 7個Unigenes被選定為實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(定量RT -PCR )驗證

4.1 差異表達基因的qRT-PCR與RNA-seq的表達比較

通過qRT-PCR (左側)和RNA-seq(右側)顯示候選的Unigene表達水平。定量qRT-PCR檢測的數據是3個重復,RNA-seq的RPKM是兩個重復的結果。

4.2 定量RT -PCR和RNA-seq之間的倍數變化的數據系數分析。

基因表達比率的倍數變化線性回歸分析
RNA-seq 與 qRT-PCR顯示顯著正相關(圖 6),證實了我們的轉錄組分析.

7個Unigenes被選定為定量RT - PCR檢測。通過從RNA-seq( x軸)和定量RT-PCR ( y軸)的log2表達比生成散點圖。

5.結論

1.我們的轉錄組數據可作為全面收集的荔枝葉片表達序列標簽(ESTs),這是未來對荔枝等密切相關的物種的基因組學研究的重要資源。
2.已確定的差異表達基因還可提供潛在候選基因,用于圓錐花序的早期葉對照下,與荔枝開花過程相關的基因功能分析。

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