广东快乐十分爱彩乐:無參三代全長轉錄組測序

广东快乐十分4个号 www.wfsmjl.com.cn 完整的轉錄本包括了從5’端到3’端polyA尾的序列,長度集中分布在1-6kb。二代測序技術由于讀長較短,得到的測序片段需要拼接,得到的轉錄本可能會產生拼接錯誤和較多的嵌合體,從而不能得到完整的轉錄本。第三代測序技術Pacbio利用單分子實時測序技術(SMRT),由于其超長的讀長(平均15kb),無需拼接即可直接獲取完整的全長轉錄本,因此可得到更高質量的轉錄本,有利于mRNA結構的研究,如可變剪切、融合基因、等位基因表達等。因此,全長轉錄本的研究越來越熱門,發表的文章影響因子也比簡單用二代測序RNA-seq要高。

目前第三代測序儀器最主要是美國太平洋生物技術公司( Pacific Biosciences)的RS II和Sequel。Sequel也是基于單分子實時測序技術的最新測序平臺,其數據產出比RS II提高了約7倍,測序成本更低、項目周期更短。

利用Pacbio三代測序儀進行全長轉錄組的測序有以下優勢:
1.超長讀長:讀長最長可達到約80kb,平均8~15kb,輕松解決二代測序所不能解決的重復序列問題;
2.通量高:RS II平臺一個SMRT cell可產生約0.5~1Gb數據,而Sequel平臺一個SMRT cell可產生5~10Gb數據;
3.無GC偏好性:
4.直接檢測堿基修飾:可直接檢測各種類型的DNA甲基化。

應用領域
獲取無參考基因組物種較完整的參考編碼序列
不同實驗處理后引起的可變剪切事件變化
更準確的定量分析

技術路線

分析內容
1. 標準信息分析

1.1 原始測序數據統計及質控

1.2 Reads分類

1.3 Reads聚類和校正

1.4 全長isoform數據統計

1.5 基因基本功能注釋
1.5.1 Nr注釋
1.5.2 GO功能注釋
1.5.3 COG/KOG注釋
1.5.4 KEGG代謝通路注釋
1.5.5 SwissProt蛋白注釋

1.6 基因高級功能注釋
1.6.1 預測編碼蛋白框(CDS)
1.6.2 轉錄因子分析
1.6.3 R基因分析(植物)
1.6.4 蛋白結構域分析(Pfam, SMART)
1.6.5 TMHMM跨膜螺旋結構預測
1.6.6 SignalP信號肽結構預測
1.6.7 蛋白O-GlcNAc糖基化位點預測(哺乳動物)
1.6.8 ProP弗林蛋白酶裂解位點預測(真核生物)

1.7 結構分析
1.7.1 串聯重復單元檢測(SSR)
1.7.2 lncRNA分析
1.7.3可變剪切分析

2. 定制化信息分析
2.1 二代數據校正三代數據(需有Illumina數據)
2.2 基因定量及差異表達分析(需有Illumina數據)
2.3 多組學關聯分析(如甲基化、蛋白組、miRNA)

樣本要求
膠圖檢測:條帶清晰,無明顯降解,無DNA污染
2100檢測:RIN值≥7.5,基線平整,200-1200bp 無峰帶;總量≥10ug(兩次建庫);濃度≥300ng/ul
OD260/280:1.6~2.2,OD260/230:1.4~2.5

項目周期
標準流程的運轉周期約為55個工作日。

參考文獻
Li J , Haratalee Y , MD Denton, et al. Long read reference genome-free reconstruction of a full-length transcriptome from Astragalus membranaceus reveals transcript variants involved in bioactive compound biosynthesis.[J]. Cell Discovery, 2017, 3:17031.
Mi K , Jae-Sung R , Tae K , et al. Alternative Splicing Profile and Sex-Preferential Gene Expression in the Female and Male Pacific Abalone Haliotis discus hannai[J]. Genes, 2017, 8(3):99-.
Liu X , Mei W , Soltis P S , et al. Detecting alternatively spliced transcript isoforms from single‐molecule long‐read sequences without a reference genome[J]. Molecular Ecology Resources, 2017, 17(6).